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Variabilidad de las inmunoglobulinas

Los mecanismos para generar diversidad en las inmunoglobulinas se diferencia en dos tipos, los que ocurren antes del contacto con el antigeno (variabilidad natural) y los que ocurren despues (variabilidad adaptada).

Mecanismos de diversidad natural

Los genes de las Ig se localizan en tres loci, la cadena pesada en el cromosoma 14. la cadena ligera κ en el cromosoma 2 y la cadena ligera λ en el 22.

Estos mecanismos nos proporcionan una variabilidad idiotipica (repertorio) de 1011 idiotipos (especificidades) diferentes de LB, que elaboramos en la médula ósea SIN la presencia del antígeno.

Para la cadena pesada existe un gen para la región variable y cinco para la región constante mu (μ), gamma (γ1, γ2 y γ3), alfa (α1 y α2), epsilon (ε) y delta (δ), una por cada isotipo. Para la cadena ligera κ solo hay un segmento constante, pero para la λ hay al menos seis, aunque funcionalmente iguales.

La cadena pesada (H) de una inmunoglobulina está codificada:

  • dominio variable (VH): por 3 segmentos génicos (exones), VH,DH y JH
  • dominio constante (CH): por 1 segmento génico CH

 

La cadena ligera (L) de una inmunoglobulina está codificada :

  • dominio variable ( VL ): por 2 segmentos génicos, VL y JL
  • dominio constante ( CL ): por 1segmento génico CL

El principal mecanismo para generar la diversidad idiotípica en los receptores para el antígeno es la recombinación del DNA al azar de los segmentos génicos V, D y J, que son los que van a codificar las zonas variables de las cadenas pesadas y ligeras, más concretamente la zona CDR3.

En el cromosoma 14 de nuestras células hay múltiples segmentos génicos VH, DH y JH que permitirán codificar un gran número de diferentes dominios variables en las cadenas H, pero que aún no son operantes: las regiones génicas V, D y J se hallan muy separadas entre sí.

En este mismo cromosomay a la derecha de estas regiones génicas (V, D y J), a gran distancia de ellas y ordenadas de izquierda a derecha, se encuentra la región génica que codifica los dominios constantes de todas las clases y subclases de cadena H (μ, δ, γ, α, y ε).

genes inmunoglobulinas

En el cromosoma 2 hay múltiples segmentos génicos Vk y Jk , que permitirán codificar gran número de dominios variables en las cadenas k,  y una única región génica de dominio constante.

En el cromosoma 22 hay múltiples segmentos génicos Vl y Jl ,que permitirán codificar gran número de dominios variables en las cadenas l.

Dentro de estos cromosomas se encuentran los segmentos para codificar las zonas variables: 75 para V, 27 para D y sólo 6 para J en las cadenas pesadas; las cadenas ligeras únicamente contendrán 2 genes V y J; además hay muchas secuencias (secuencias C) para las zonas constantes de las cadenas pesadas y ligeras.

Reordenamiento de la cadena pesada

Los segmentos que codifican las regiones variables están muy separados en el genoma de todas las células menos en LB, debido a que durante el desarrollo en la medula osea los segmentos VDJ se yuxtaponen por un proceso de b>recombinación somatica.

El DNA inmaduro de la línea germinal se recombina, uniendo primero un segmento al azar de D a un segmento al azar de J y más tarde la secuencia DJ se une a un segmento V cualquiera, también escogido aleatoriamente. A continuación se une esta nueva región genética VDJ a la región génica de los dominios constantes. Este reordenamiento se produce en todas las células Pro-B de manera independiente. La base genética que se genera en este momento se mantiene durante toda la vida celular.

reconvinacion vdj

Al final de estos procesos, si el reordenamiento de genes es exitoso (tiene sentido) la célula sintetiza cadenas μ (pesada) y estas cadenas aparecen en el citoplasma.La célula pasa a estadío Pre-B.

Se llama recombinasa al conjunto enzimático que actúa para producir la recombinación VDJ y VJ. Algunos de estos enzimas poseen actividad endonucleasa, solo actúan en linfocitos en desarrollo y son responsables de los cortes en la cadena ADN. Otros enzimas de este conjunto se ocupan de unir los segmentos génicos seleccionados.Para que los enzimas de recombinación actúen, tienen que reconocer una secuencia de 7 bases (la secuencia de inserción), que va por delante de cada segmento excepto del segmento δ. Esa secuencia es el lugar por el que se corta el DNA.

Para que se puedan llevar a cabo las recombinaciones hace falta la participación de dos enzimas: las recombinasas codificadas en los genes RAG-1 y RAG-2. Estas recombinasas sólo se expresan en células inmaduras y además solo se activan en los linfocitos B y en los linfocitos T, en el resto de células del organismo permanecen inactivas. Para poder actuar, las recombinasas tienen que reconocer las secuencias de inserción mencionadas anteriormente, que están constituidas por 7 bases que se repiten varias veces.

Este DNA recombinado se transcribe creando un transcrito primario con información para VDJ, μ (mu) y δ (delta). En el RNAm definitivo se encontrará información únicamente para uno de los dos, bien para μ (mu) o para δ (delta). Dependiendo de la cadena que se exprese en cada RNAm maduro, se generarán respectivamente IgM o IgD.

La recombinación de VDJ esta dirigida por unos segmentos génicos muy conservados denominados señales de recombinación. Estas están formadas por un heptamero y un nonamero conservados, separados por una región espaciadora no conservada de 12 o 23pb.

Las regiones espaciadoras son importantes para que el proceso se realice de forma ordenada, ya la secuencia señal que tiene un separado de 12pb solo se puede unir a una con 23pb.

Estas secuencias se encuentran de forma alterna en los diferentes segmentos génicos.

La recombinación somatica es imprescindible para que se expresen las Ig, ya que permite la transcripción de los genes.

Reordenamiento de las cadenas ligeras

Este reordenamiento de los genes de la cadena L comienza siempre con el reordenamiento de los genes de la cadena k, se produce en todas las células Pre-B de manera independiente y cada célula Pre-B reordena los genes de la cadena k al AZAR.

Este reordenamiento consiste en recombinaciones somáticas: tomar 1 segmento génico Vk y 1segmento génico Jk al azar , unirlos y a continuación unir esta nueva región genética VJ a la región genética del dominio constante.

Al final de estos procesos si el reordenamiento de genes tiene sentido la célula sintetiza cadenas k, con lo que se sintetiza una molécula IgM completa y expresa el receptor para el antígeno (BCR) clase IgM y la célula pasa a estadío LB inmaduro.

En la cadena ligera pasa lo mismo que en la pesada pero en este DNA no hay segmentos D, solamente V y J. Por eso en cada célula se combinará un V con un J, sin un D, y después se transcribirá en un RNA primario para posteriormente quitar los intrones y traducirlo, creando la cadena ligera.

Exclusion alelica

Cada LB presenta en su membrana un solo tipo de Ig, con dos sitios de unión, pero idénticos por lo que tiene una sola especificidad (monoespecifidad). Esto es debido a que, aunque existen dos genes para cada cadena de Ig, solo uno es reordenado de forma productiva. Esto se denomina exclusión alélica. Asi el el LB responde a un determinado antígeno y produce anticuerpos que se unen exclusivamente a él.

Como siempre, poseemos dos alelos (materno y paterno) para cada uno de los genes de las inmunoglobulinas. Las recombinaciones somáticas de la cadena μ comienza en uno cualquiera de ellos:

Este proceso de recombinación tiene un orden y unas reglas. Una de ellas es la exclusión alélica. En cada célula Pro-B tenemos dos oportunidades para conseguir un reordenamiento productivo de los genes de las cadenas pesadas.

Lo primero que se va a reordenar son los genes de la cadena pesada, empezando por uno de los alelos. Si ese alelo es productivo se crea un RNAm de μ que permite la fabricación de una cadena pesada, además de inhibir el reordenamiento del otro alelo del gen. Además, la síntesis de la cadena pesada activa el reordenamiento de la cadena ligera.

exclusion-alelica

Si el alelo de la cadena pesada escogido no fuera productivo se iniciaría el reordenamiento del otro alelo de la misma forma que lo ha hecho el primero.  Si ninguno de los dos alelos fuera productivo, la célula estaría destinada a la apoptosis por no ser útil.

La aparición en el citoplasma de las cadenas μ estimula el reordenamiento de uno de los alelos de la cadena ligera κ.

En cada célula Pre-B tenemos 4 oportunidades para conseguir un reordenamiento productivo de los genes de las cadenas pesadas.

Con la cadena ligera ocurre prácticamente lo mismo. La célula reordena uno de los alelos que codifica para κ (kappa) y si es productivo continúa con la transcripción. Por lo tanto, inhibe el otro alelo y también el segmento que codifica para λ (lambda). Si no fuese productivo continuaría con el reordenamiento del otro alelo de κ. Si ninguno de los dos alelos de kappa fuera productivo pasaría al reordenamiento de de las zonas de lambda, siguiendo el mismo proceso que con las cadenas kappa. Si finalmente ninguno de los 4 alelos fuera productivo la célula pasaría al proceso de apoptosis.

exclusion-alelica2

El CDR3 es la zona que corresponde al empalme VJ en la cadena ligera, o al de VDJ en la cadena pesada.

Mecanismos de diversidad de la union

La diversidad de repertorio natural de BCR que hasta ahora hemos conseguido se ve aumentada por dos nuevos mecanismos:

Diversidad de unión: las recombinasas no son muy precisas y cuando cortan el DNA pueden cortar uno o unos pocos nucleótidos mas o menos. Esta imprecisión incrementa la diversisdad ya que puede cambiar el marco de lectura al añadir o quitar nucleotidos. Los nucleótidos arrastrados durante la recombinación se llaman nucleótidos P (suelen ser palindromicos).

recombinasas
diversidad-union

El enzima TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) añade nucleótidos, a los que se llama nucleótidos N, en las uniones VHDH y DH JH. Solo actúa sobre el ADN de las cadenas pesadas porque, en los LB, el enzima TdT solo se expresa durante el reordenamiento de estas cadenas, en la célula Pro-B.

Combinando V, (D), J y los nucleótidos N/P se consigue que los Ig de cada linfocito sean únicos, y especialmente únicos en la región CDR3. Esta característica se emplea en el análisis de tumores, para saber si son monoclonales (una célula mutada) o policlonales (más de una célula mutada).

En resumen los mecanismos de variabilidad de las inmunoglobulinas son:

  • Múltiples genes V, D y J ( cadena H) y V y J ( cadena L)
  • Reordenamiento de genes V, D y J al azar en la cadena H
  • Reordenamiento de genes V y J al azar en la cadena L. Todos los reordenamientos de la cadena L son independientes de los de la cadena H. Así es posible que se produzca el mecanismo 4.
  • Combinaciones de todos los reordenamientos V, D y J posibles de la cadena H con todos los reordenamientos V y J posibles de la cadena L
  • Diversidad en la unión: nucleótidos P y N

El repertorio potencial de linfocitos B que podrían salir de la médula ósea es de unos 1011 clones distintos. En la práctica hay unos 107 clones, porque muchos linfocitos B fracasan en el proceso de generación de receptores y muchos fenotipos “teóricos” no llegan a ver la luz.

Coexpresión de IgM e IgD

El exón ( VDJ ) que codifica el dominio variable de la cadena H y que se ha generado por recombinación somática queda próximo a Sm (secuencia de inserción con m). Por ello la primera cadena pesada que se sintetiza es la μ. Esta secuencia de inserción es compartida por m y d y el exón VDJ puede ser transcripto con los genes Cm o Cd.

Una vez que el LB expresa en membrana el receptor IgM comienza a transcribirse la cadena d y al expresarse el receptor IgD, el LB, transcribirá alternativamente uno u otro hasta su activación por el antígeno.

IgM e IgD son las primeras clases de Ig que un linfocito B puede producir, aún sin ser activado.

Al principio, genera RNAm para cadenas μ (sólo se producen IgM): el transcrito primario de RNAm lleva la información de VDJ, μ y δ; se elimina la información de δ y se fabrican cadenas μ, que al asociarse con cadenas ligeras dan lugar a IgM.

Más adelante se hace un splicing alternativo para μ y para δ (dando lugar tanto a IgM como a IgD): en la maduración del RNAm se elimina alternativamente la información de una de las cadenas y se produce la otra, que al unirse a las cadenas ligeras da lugar a IgM o a IgD. El idiotipo, aún así, será igual en ambas Ig, a pesar de que su isotipo cambie.

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